一、 實驗流程

1. 蛋白質提取

1.1 每個蛋白樣品組織加入對應標記的1.5 ml離心管中，約100mg每個樣品。在液氮中研磨完全至粉末狀。加入200 μl的RIPA裂解液 （康為世紀強裂解液CW2333S；裂解液中加入PMSF，終濃度1 mM；加入Phosphatase Inhibitor Cocktail （康為試劑，CW2383），終濃度1X）。

1.2 樣品在冰上靜置30 min。15 min顛倒混勻一次。

1.3 樣品離心，12,000 g 4 ℃離心20 min。

1.4 吸取上清溶液即為蛋白樣品。（盡量避免吸取底層組織沉淀。）樣品顏色為略微淺黃色。

2. 蛋白質定量 （康為世紀 BCA Protein Assay kit）

2.1 稀釋BSA標準品

采用梯度稀釋方式，從高濃度逐級稀釋。每個樣品從前一個樣品中吸取對應的體積。樣品6混合均勻后吸出25 μl棄用，故所有樣品均為25 μl。

2.2 準備樣品 每個樣品加入2.5 μl加入22.5 μl lysis buffer，混合均勻備用。每個樣品做兩個重復。

2.3 配置BCA工作液 BCA-A液與BCA-B液按1:50體積比配成工作液，充分混勻。

2.4 定量檢測 樣品及標準品中每管加入200 μl工作液，混合均勻。然后放到37℃水浴鍋中反應30 min。反應結束后立即冷卻終止反應。在3-5 min內檢測每個樣品和標準品562 nm吸光值。

2.5 根據BSA標準品檢測結果繪制標準曲線，計算每個樣品中的蛋白濃度。

3. Western Blotting 

3.1. 蛋白樣品準備

每個樣品的上樣量為20 μg （具體樣品WB條件見下表格），加入對應的5 X SDS （β-ME終濃度1%），用buffer補齊至10μl。95 ℃沸水浴中煮沸10 min。

3.2 SDS-PAGE膠制備 配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，進行蛋白樣品電泳。

3.3 電泳后進行轉膜，封閉，一抗免疫 （一個目的蛋白/GAPDH內參），二抗免疫，顯色過。具體流程見流程圖。

4. 蛋白表達量定量分析

利用Image lab 對ECL化學發光顯色后結果，轉化成灰度圖后，對信號強度進行相對定量分析。